期刊简介
主要报道和刊登国内外、特别是我国消化病学者具有创造性的、有较高学术水平的基础和临床研究论文、研究快报等. 对具有中国特色的研究论文, 如食管癌、胃癌、肝癌、大肠癌、病毒性肝炎、幽门螺杆菌、中医中药、中西医结合和基于作者自己研究工作为主的综述性论文, 将优先发表. 读者对象为基础研究或临床研究的消化专业工作者。
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首页>世界华人消化杂志
- 杂志名称：世界华人消化杂志
- 主管单位：华人消化杂志；新消化病学杂志
- 主办单位：山西省科学技术厅
- 国际刊号：14-1260/R
- 国内刊号：14-1260/R
- 出版周期：旬刊
期刊荣誉：国家期刊奖百种重点期刊（第二和第三届）期刊收录：上海图书馆馆藏, 国家图书馆馆藏, 文摘与引文数据库, 维普收录(中), 医学文摘, 知网收录(中), CA 化学文摘(美), 万方收录(中)
肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
赵弘智；梁平；李靖；李洪艳；黄小兵
关键词：人原发性肝癌细胞株, 克隆和表达, hepatocellular carcinoma, 新基因, subtractive hybridization, 原发性肝细胞肝癌, 相关基因, 末端快速扩增法, 插入片段, 保守序列, gene expression, 文库, 同源性比较, 序列数据库, 神经系统肿瘤, 培养基, 肝组织, 方法, 表达序列标签, 消减杂交法
摘要：目的:克隆原发性肝癌相关新基因.方法:利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST),长447 bp,经Genebank检索,90%无同源性.在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2:5'-CGCATAGTACCAGTATCGAC AAAGG-3',3'NGSP2:5'-TCCACATTACGGACC CGACGGATT-3'),利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列.人原发性肝癌细胞株HepG2,体外传代培养,培养基为RPMI1640培养基.提取HepG2总RNA,方法参照SV Total RNAIsolation System 的说明进行.RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit.将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收,然后将其克隆到PMD18-T Vector中,提纯质粒后进行酶切鉴定,确认质粒内有插入片段,由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序,将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank与dbEST、 nr数据库进行同源性比较,确认代表新基因的EST并且登录GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.GOV/submission).3便病理标本取自西南医院肝胆科,病理证实均为原发性肝细胞肝癌,分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA.将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针,利用Clontech公司的 ExpressHYBTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达,方法参照ExpressHYBTM Hybridization Solution user manual说明进行.同时,利用一联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE(series analysis of gene expression,SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析,从而确定其组织分布.结果:得到5条3'EST(694 447-3,724 447-3,697 447-3,711 447-3 692 447-3;大小500-550bp),5条3'EST均为登录GenBank(登录号:CK730344,CK730345,CK730346,CK730347,CK730348).对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3 724 447-3)进行序列分析后,发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列.RNA印记分析显示694 447-3,724 447-3在3例肝癌组织中的表害强度时显高于对应的正常组织.通过SAGE文库分析基因的表达谱,发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的政党组织文库.结论:克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多期因家庭成员.利用RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.
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